6.根据判读表判读所有反应（阳性或阴性）。
7.结果判定：每3个试验为1组，阳性按顺序赋予1、2、4的数值，根据试子条上20个反应可得到一个7位数的编码（触酶反应作为第21个反应），根据数据库（V4.1）得到鉴定结果。也可将试子条直接插入计算机鉴定系统，直接得到结果。
附件6
抗菌药敏感性试验操作规程和判断标准
一、抗菌药物敏感性试验（微量肉汤稀释法）操作方法
1．目的
本操作方法用来规范微量肉汤稀释法测定肠道杆菌最小抑菌浓度（MIC）的操作，并统一判定标准。
2．适用范围
本标准操作规程适用于按照微量肉汤稀释法进行肠道杆菌和金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度的测定（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌除外）。
3．职责
进行该试验的检验员应当按照本标准操作规程进行。
4．试验依据与原理
微量肉汤稀释法测定细菌最小抑菌浓度是定量检测某一抗生素对细菌体外活性的一种标准方法。试验在制成一系列各种浓度的抗生素肉汤溶液中分别加入等量的一定浓度的菌液，过夜培养后，判读最小抑菌浓度（MIC）。
5．材料、仪器与试剂的准备及基本要求
5.1 材料和仪器
5.1.1 操作室：操作室内设有能达到空气消毒的紫外灯。实验前后应用75%乙醇溶液擦拭操作台面及可能污染的死角，开启紫外灯杀菌1小时。
5.1.2 旋涡混合振荡器：可调速
5.1.3 恒温培养箱：35±2℃
5.1.4 灭菌试管、容量瓶、刻度吸管等。
5.1.5 园底96孔板、接种针或接种环（镍铬丝或一次性无菌塑料制品）。
5.1.6 无菌衣、裤、帽、口罩：用牛皮纸包严，灭菌备用或用一次性的无菌物品代替。
5.1.7 8头或12头移液器、吸头等
5.2 试剂与培养基
5.2.1 75%乙醇溶液
5.2.2 无菌0.9%氯化钠溶液
5.2.3 新洁尔灭（1：1000）溶液
5.2.4 营养琼脂培养基
5.2.5 水解酪蛋白肉汤（Mueller-Hinton broth Medium，MH肉汤，含20-25 mg钙/ L，10-12.5mg镁/L）
5.2.5.1 10mg/mL Ca2＋ 和Mg2＋的配制
Ca2＋的配制：3.68g CaCl2·2H2O加入100mL三蒸水中，含量为10mg Ca＋＋/mL，0.22µm滤膜过滤除菌后置于4℃冰箱保存备用。
Mg2＋的配制：8.36g MgCl2·6H2O加入100mL三蒸水中，含量为10mg Mg＋＋/mL，0.22µm滤膜过滤除菌后置于4℃冰箱保存备用。
5.2.5.2 使用时加入适量的Ca2＋和Mg2＋到MH肉汤中，使MH肉汤中Ca2＋和Mg2＋的含量分别为20-25 mg Ca2＋/ L和10-12.5mg Mg2＋/L。
5.2.7 抗菌药物：一般采用标准品或对照品
5.3 质控菌种
5.3.1 肠道菌质控菌株：大肠杆菌ATCC 25922。
5.3.2 金葡菌质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 29213。
5.4 抗菌药物贮备液的制备
5.4.1抗菌药物的称量
计算公式：
W（mg）＝
式中：W-称取抗菌药物的重量；
V-制备抗菌药物的溶液体积；
C1-制备抗菌药物的溶液浓度；
C2-抗菌药物的含量。
5.4.2 加入一定量的溶剂稀释至一定浓度。贮备液的浓度至少应为1280µg/ml，或最高测试浓度的10倍以上。
5.4.3 将抗菌药物贮备液分装于无菌小瓶中，最好置-70℃以下保存，有效期为半年。注意不能反复冻融。临用前从冰箱中取出，使融解并与室温一致。
5.5 0.5麦氏单位（McFarland）标准比浊液或比浊计
药敏试验菌悬液的浊度，以BaSO4浊度液为标准，相当于0.5麦氏单位（McFarland），按如下方法配制：
5.5.1 取0.048mol/L的氯化钡溶液（1.175%w/v，BaCl2·2H2O）0.5ml，加至99.5ml 0.18mol/L的硫酸溶液（1%v/v）中，不断搅拌使成混悬液。
5.5.2 用1cm光路的吸收池，在625nm下测定6.2.1的溶液，0.5标准麦氏单位（Mcfarland standard）的吸收度应为0.08～0.10。
5.5.3 取4～6ml硫酸钡混悬液，置与稀释菌悬液相同规格的具塞试管中，密封，室温避光保存。
5.5.4 临用前将标准比浊液在漩涡震荡器上混合均匀，如出现大颗粒，则需重新配制。放置后硫酸钡标准比浊液的浊度会产生变化，因此应每月进行更换。
6 测定步骤
6.1 分离单菌落
将质控菌株和测试菌株分别用四分划线法转种于营养琼脂平面，置37℃培养箱中培养，以得到单个纯菌落。
6.2 抗生素工作溶液的制备
将抗菌药物贮备液用M－H肉汤稀释至一定的工作浓度后，按2倍稀释法进一步稀释至一系列所需浓度（一般10个浓度梯度），然后按顺序用排枪点入96孔板中，每块板横向10个稀释度，每孔0.1ml，设阴性和阳性对照，可测8个细菌。
6.3 菌液制备
6.3.1 生长法
6.3.1.1 用接种环挑取营养琼脂斜面上的3～5个质控菌或供试菌单个纯菌落，加入无菌4～5ml肉汤（如胰酶消化大豆肉汤）的试管中。
6.3.1.2 置35～37℃培养箱中培养，一般为2～6小时，使培养后的菌液浓度达到或超过0.5标准麦氏单位。
